- Физико-химические свойства белков
- Факторы стабилизации белка в растворе
- Денатурация и ренатурация белка: что это, факторы и стадии
- Классификации белков
- Методы исследования белков
- Высаливание
- Диализ
- Гель-фильтрация
- Электрофорез
- Изменение белкового состава организма
- Ультрацентрифугирование белков: что это?
- Методы исследования белковых молекул
Физико-химические свойства белков
Физико-химические свойства белков обусловлены их структурной организацией и зависят от факторов внешней среды.
- 1. Высокая молекулярная масса — от 6000 до нескольких миллионов Дальтон.
- 2. Амфотерность – способность белка проявлять кислотные и основные свойства.В молекуле белка есть катионообразующие группы (аминогруппы) и анионообразующие (карбоксильные группы). Если преобладают карбоксильные группы, то заряд молекулы отрицательный (слабокислые свойства), если аминогруппы – то положительный (основные свойства). Заряд белка также зависит от рН среды. В кислой среде молекула приобретает положительный заряд, в щелочной – отрицательный.
- 3. Гидратация и растворимость. Зависит от сродства аминокислотных остатков на поверхности белковой молекулы к воде.
- 4. Способность к ионизации. Благодаря наличию аминогрупп и карбоксильных групп белки – амфотерные полиэлетролиты. В растворах находятся в виде биполярных ионов.
- 5. Способность радикалов аминокислот к химическим превращениям и взаимодействиям.
- 6. Способность к денатурации и ренатурации.
- 7. Способность к гидролизу. Благодаря пептидной связи белки подвергаются кислотному, щелочному и ферментативному гидролизу. При этом образуются свободные аминокислоты.
Факторы стабилизации белка в растворе
- 1. Гидратная оболочка – слой молекул воды на поверхности белковой молекулы. Вода связана с белковой молекулой слабыми связями («связанная вода»). Гидратная оболочка не дает белковым молекулам сближаться и выпадать в осадок.
- 2. Заряд белковой молекулы. На поверхности белковой молекулы есть положительно и отрицательно заряженные радикалы аминокислот. Количество этих групп и, следовательно, заряд белков зависят от рН среды. Значение рН, при котором белок имеет нулевой заряд, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В ИЭТ белки наименее устойчивы. При потере заряда в ИЭТ белки агрегируют и выпадают в осадок.
Денатурация и ренатурация белка: что это, факторы и стадии
Денатурация – нарушение нативной конформации белка. При денатурация изменяются физико-химические свойства и теряется биологическая активность белка.
При денатурации не изменяется первичная структура, но изменяется вторичная, третичная и, если есть, четвертичная структура.
Факторы денатурации:
- 1. Физические (высокая температура, вибрация, радиация, УФО, ультразвук и др.).
- 2. Химические (мочевина, кислоты и щелочи, соли тяжелых металлов, растительные алкалоиды, органические растворители и др.).
Стадии денатурации:
- 1.Рыхлый клубок.
- 2.Стадия нити.
- 3.Случайный клубок.
При денатурации уменьшается растворимость, изменяется электрофоретическая подвижность, изменяется число реакционных групп.
Способность белков к денатурации используется в медицине.
- Пастеризация продуктов.
- Стерилизация шовного материала.
Ренатурация – восстановление нативной конформации денатурированного белка. При ренатурации восстанавливаются физико-химические свойства белков и их активность.
В организме происходит быстрая ренатурация при помощи специфических белков — шаперонов. Шапероны присоединяются к денатурированному белку слабыми связями и создают условия для ренатурации.
Классификации белков
- 1.По растворимости — водорастворимые (альбумины), солерастворимые (глобулины), спирторастворимые (протамины), нерастворимые (склеропротеины).
- 2.По форме белковой молекулы – фибриллярные, глобулярные, мембраносвязанные.
- 3.По химическому строению – простые белки (состоят только из аминокислот) и сложные (состоят из аминокислот и небелковой части – липидов, углеводов, металлов, нуклеиновых кислот).
- 4.По функциям – структурная, каталитическая, регуляторная, двигательная, транспортная, рецепторная, защитная, резервная, опорная.
Методы исследования белков
- 1.Высаливание.
- 2.Диализ.
- 3.Гель-фильтрация.
- 4.Электрофорез.
Высаливание
Растворимость белков сильно зависит от концентрации солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы.
При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации (засаливание).
При высокой ионной силе молекулы белков лишаются гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и выпадению белка в осадок (высаливание).
Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, например (NН4)2SО4, разделить (фракционировать) смесь белков.
Диализ
Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ.
Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором.
После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.
Гель-фильтрация
Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов (1а). Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором.
Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля, будут перемещаться с высокой скоростью. Средние и небольшие белки будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля. На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций. Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы.
Электрофорез
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
В настоящее время электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) является общепринятым методом определения гомогенности белковых препаратов.
Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля. Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда. Поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы.
Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфа-том натрия (C12H25OSO3Na), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами. Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют.
Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики.
Электрофорез проводят в тонком слое полиакриламида.
После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя, В качестве примера на схеме 3 приведена электрофореграмма трех препаратов: клеточного экстракта, содержащего сотни белков; выделенного из экстракта гомогенного белка; контрольной смеси белков с известными молекулярными массами.
Изменение белкового состава организма
В процессе развития организма белковый состав значительно меняется. В специализированных тканях появляются специфические белки.
Например, гемоглобин в эритроцитах, родопсин в клетках сетчатки глаза.
Специализированные клетки отличаются и по количеству белков, присутствующих во всех или во многих тканях организма.
Белковый состав организма здорового взрослого человека относительно постоянен.
Вариации количества отдельных белков могут определяться составом пищи, режимом питания, физиологической активностью.
При различных заболеваниях происходит изменение белкового состава тканей. Эти изменения называют протеинопатиями.
Различают наследственные и приобретенные протеинопатии. Пример наследственной протеинопатии – гемоглобинопатии.
В зависимости от роли дефектного белка в жизнедеятельности организма наследственные протеинопатии могут вызывать болезни или летальный исход.
При наследственных протеинопатиях нарушается первичная структура белка.
Приобретенные протеинопатии развиваются в результате болезни.
В этом случае первичная структура белка не нарушается, а происходит
1. количественное изменение белков в пораженном органе или ткани.
2. изменение биологической активности белков из-за нарушения нативной конформации:
- – при сдвигах рН среды в щелочную или кислую сторону;
- – при присоединении низкомолекулярных веществ к белкам, например, при сахарном диабете к белкам крови присоединяется глюкоза;
Изменение белкового состава крови и мочи используется для диагностики ряда заболеваний.
Ультрацентрифугирование белков: что это?
Ультрацентрифугирование, метод разделения и исследования высокомолекулярных соединений, вирусов и субклеточных частиц с помощью ультрацентрифуги.
Идея ультрацентрифугирования была предложена А. В. Думанским в 1913, однако разработка современной теории седиментационного анализа стала возможной только после того, как Т. Сведберг в 1926 сконструировал высокоскоростную ультрацентрифугу, обеспечивавшую ускорение 105 g.
Принято различать 2 типа ультрацентрифугирования: препаративное и аналитическое. Препаративное ультрацентрифугирование применяют для фракционирования и выделения биополимеров в количествах, достаточных для практических целей.
Широко используют ультрацентрифугирование в градиенте плотности растворовсахарозы, глицерина, декстринов; оно позволяет разделять смеси веществ на отдельные компоненты, различающиеся эффективной массой и коэффициентом трения частиц или молекул.
Применение зональных и проточных роторов дало возможность значительно повысить объёмы растворов фракционируемых частиц и использовать их для очистки вируса гриппа при изготовлении вакцин.
Аналитическое ультрацентрифугирование используют для исследования гомогенности (чистоты) препаратов биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов), а также для определения константседиментации, молекулярной массы, констант ассоциации и размеров макромолекул.
Ультрацентрифугирование применяется в медицине при клинической диагностике, для приготовления кровезаменителей и т.п.
Методы исследования белковых молекул
Препараты высокоочищенных белков находят разнообразное применение в научных исследованиях, медицине и биотехнологии. Так как многие белки, и в особенности глобулярные, высоколабильны, выделение проводят с помощью предельно мягких методов и при пониженной температуре (0-5°С). К таким методам относится ионообменная хроматография. Другие методы выделения белков представлены в этом разделе.
Растворимость белков сильно зависит от концентрации солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы. При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов (светло-синие кружочки) связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации (засаливание).
При высокой ионной силе молекулы белков лишаются гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и выпадению белка в осадок (высаливание). Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, например (NН4)2SО4, разделить (фракционировать) смесь белков.
Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ.
Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.
Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул.
Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов (1а).
Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков (1б) вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля (помечены красным цветом), будут перемещаться с высокой скоростью.
Средние (зеленого цвета) и небольшие белки (синего цвета) будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля (1в).
На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций (2). Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы (3).
В настоящее время электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) [ДСН-ПААГ-электрофорез (SDS-PAGE)] является общепринятым методом определения гомогенности белковых препаратов.
Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля (см. с. 270). Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда.
Поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы. Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфа-том натрия [ДСН (SDS)] (C12H25OSO3Na), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами (см. с. 34). Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют.
Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики (1).
Электрофорез проводят в тонком слое полиакриламида (2). После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя, В качестве примера на схеме 3 приведена электрофореграмма трех препаратов: клеточного экстракта, содержащего сотни белков (а); выделенного из экстракта гомогенного белка (б); контрольной смеси белков с известными молекулярными массами (в).