Реакция связывания комплемента: описание и применение
Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело.
Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным.
Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О. Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ.
Если АГ и ATсоответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.
Протекание реакции
Реакция протекает в две фазы с участием двух систем; бактериальной и гемолитической. В первой реакции (специфическая) участвуют антиген 4-+ антитело + комплемент.
Положительный результат реакции, наступающий при соответствии антител антигену, характеризуется образованием специфического бактериального комплекса антиген — антитело с адсорбированным, или, как говорят, «связанным», комплементом.
Оставаясь невидимым, комплекс не вызывает никаких внешних изменений той среды, в которой он образовался. Отрицательный результат РСК имеет место при отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом сыворотки и характеризуется сохранением свободного активного комплемента. Первая фаза РСК может проводиться в термостате при 37°С (1—2 ч) или в холодильнике при 3—4°С (18—20 ч).
При длительном образовании иммунного комплекса антиген-антитело на холоду происходит более полное связывание комплемента и вследствие этого чувствительность реакции увеличивается. При постановке сравнительных опытов советским иммунологом акад.
В. И. Иоффе и его учениками было показано, что в условиях длительного связывания комплемента на холоду можно уловить в 100—500 раз меньшие количества антигена и получить положительные результаты при больших разведениях иммунной сыворотки, чем в опыте связывания комплемента при температуре 37 °С в течение 1—2 ч.
Вторая фаза реакции (индикаторная) происходит между реагентами гемолитической системы (смесь 3% взвеси эритроцитов и гемолитической сыворотки в равных объемах) при температуре 37 °С только при наличии комплемента, оставшегося свободным от первой фазы реакции (реакция отрицательная).
При отсутствии свободного активного комплемента гемолиза эритроцитов под действием специфических гемолизинов не наступает (реакция положительная).
Компоненты
Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).
Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.
В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.
Механизм реакции
РСК проводят в две фазы:
- 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент;
- 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним.
В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная.
Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.
Применение
Реакцию связывания комплемента можно применять для:
1) выявления специфических антител в неизвестной сыворотке на основании взаимодействия их с антигеном известной природы;
2) изучения свойств антигена в реакции с известной специфической сывороткой. Подготовка ингредиентов для постановки РСК.
1. Сыворотку крови, полученную для исследования, накануне постановки реакции прогревают в водяной бане при 56°С в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Инактивированная сыворотка может храниться при температуре 3—4°С в течение 5—6 дней. В день постановки-опыта сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:5 (0,1 мл исследуемой сыворотки,+ 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия).
2. Антигеном для постановки РСК могут быть культуры разнообразных микробов, бактериальные белки и экстракты, полученные из микробных культур, патологически измененных и нормальных органов и тканей. Особенности приготовления антигена определяются характером инфекционного процесса и особенностями его возбудителя.
3. Комплементом является смесь сывороток, полученная от 3—5 здоровых морских свинок, или сухой комплемент в ампулах.
Непосредственно перед употреблением сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида «атрия в отношении 1 : 10, получая основной раствор.
4. Гемолитическую сыворотку перед постанов кой опыта инактивируют прогреванием при температуре 56 °С в течение 30 мин. Для постановки основного опыта РСК, а также для титрования комплемента и антигена применяют гемолитическую сыворотку в тройном титре. Например, если титр гемолитической сыворотки 1: 1800, в реакции применя ют разведение сыворотки 1 : 600.
5. Эритроциты получают из дефибринированной кро ви барана. Кровь для удаления пленок фибрина фильтруют через трехслойный марлевый фильтр. Полученный фильтрат центрифугируют, сыворотку отсасывают и сливают, а эритро циты промывают 3—4-кратным центрифугированием с изото — «ическим раствором хлорида натрия. При последнем промы вании эритроцитов надосадочный слой жидкости должен быть совершенно прозрачным.
Из отмытых эритроцитов готовят 3% взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия. Подготовив указанным выше способом ингредиенты, участвующие в РСК, приступают к титрованию гемолитической сыворотки, комплемента и антигена.
Схема постановки основного опыта РСК
№ системы | Ингредиенты, мл | Опыт | Контроли | |
сыворотки | антигена | |||
1. | Исследуемая сыворотка в разведении 1:5 Антиген (рабочая доза) Комплемент (рабочая доза) Изотонический раствор хлорида натрия | 0,5 0,5 0,5 — 37° С – 1 ч | 0,5 — 0,5 0,5 | — 0,5 0,5 0,5 |
2. | Гемолитическая система* | 1,0 37° С – 1 ч | 1,0 | 1,0 |
Примечание: * — гемолитическую систему готовят, смешивая в равных количествах гемолитическую сыворотку в тройном титре и 3% взвесь эритроцитов барана; выдерживая смесь в течение часа при 37° С.
Результаты РСК предварительно учитывают после извлечения пробирок из термостата и окончательно – спустя 15-18 ч после пребывания их при комнатной температуре или в холодильнике.
Интенсивность реакции выражают плюсами:
++++ — реакция резко положительная, характеризующаяся полной задержкой гемолиза (эритроциты оседают на дно, жидкость бесцветная);
+++ — реакция положительная, характеризующаяся частичным гемолизом (лизировано ~ 25% эритроцитов, осадок меньше, жидкость розовая);
++ — реакция положительная, характеризующаяся гемолизом (лизировано ~50% эритроцитов, осадок небольшой, жидкость розовая);
+ — реакция сомнительная (лизировано ~75% эритроцитов, незначительный осадок, жидкость интенсивно окрашен1.;
_ — реакция отрицательная (лизированы все эритроциты, жидкость интенсивно окрашена и прозрачна – лаковая кровь).
Достоверность результатов подтверждается контролями ингредиентов.
Заполните дома таблицу 2. Таблица 2.
№ пп | Контроли | Контролируемое свойство |
1. | КС = С + К + Г + Э + физ. раствор | |
2. | КА = А + К + Г + Э + физ. раствор | |
3. | КГС = К + Г + Э + физ. раствор | |
4. | КГ = Г + Э + физ. раствор | |
5. | КЭ = Э + физ. раствор | |
6. | КК = К + Э + физ. раствор |
Обозначения:
С – сыворотка; А – антиген; К – комплемент; Г – гемолитическая сыворотка;
Э – эритроциты; ГС – гемолитическая система.
Оценка результатов:положительная реакция с интенсивностью не меньше ++ при достоверных контролях свидетельствует о наличии антител и серологическом подтверждении клинического диагноза; отрицательная реакция при достоверных контролях свидетельствует о том, что антитела не выявлены и серологически клинический диагноз не подтвержден.
РСК используется, помимо диагностики хронической гонорее, при риккетсиозах, вирусных и других инфекциях.
2. Учтите и оцените результаты РИФ (прямой) с исследуемым материалом (отделяемое карбункула) и люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой.
Постановка: готовится фиксированный препарат-мазок из исследуемого материала, на который наносится люминесцирующая сибиреязвенная сыворотка, содержащая антитела к бациллам сибирской язвы, меченные флюоресцентным красителем (ФИТЦ – флюоресцеина изотиоцианат).
Препарат помещают во влажную камеру, инкубируют 30 мин при 37°С, после чего его промывают водой и высушивают. Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, позволяющего освещать препарат ультрафиолетом, что заставляет флюорохром светиться.
Критерии учета и оценки:при положительной РИФ – в результате соединения специфических антител, меченых флюорохромом, с антигенами микробных клеток в препарате выявляют светящиеся микроорганизмы, сходные по морфологии, размерам и взаимному расположению с предполагаемым возбудителем.
Бациллы сибирской язвы – это крупные палочки длиной до 7-8 мкм, с обрубленными концами, располагающиеся в патологическом материале короткими цепочками, парами или одиночно.
3. Учтите и оцените результаты ИФА с сыворотками доноров на ВИЧ-инфекцию.
Постановка: для определения специфических антител используют специальные панели из полистирола, в лунках которых фиксирован инактивированный вирус или его антигены. В лунки вносят сыворотки обследуемых и инкубируют.
При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляют промыванием буферным раствором.
Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные пероксидазой. Если в исследуемой сыворотке присутствовали искомые антитела, то на данном этапе они, выступая в качестве антигена, прореагируют с меченными античеловеческими антителами. Добавление после отмывки субстрата (ортофенилендиамина – ОФ5.
позволяет учесть результаты реакции. Образование продукта, окрашенного в желто-коричневый цвет, оценивается как положительная реакция.
Критерием достоверности являются контроли: с сывороткой, заведомо содержащей антиВИЧ — ИФА «+» и сывороткой, заведомо не содержащей антиВИЧ — ИФА «-».
Для проведения ИФА широко используют 96-луночные полистироловые планшеты, т. к. на полистироле легко адсорбируются антитела, а после специальной обработки – различные антигены. Для работы с этими планшетами используются многоканальные автоматические пипетки, позволяющие вносить ингредиенты одновременно в несколько лунок панели, а также автоматические и полуавтоматические устройства для промывания лунок.
Существуют и специальные автоматы, позволяющие осуществлять все эти этапы ИФА практически без участия человека.
Реакция связывания комплемента. Механизм. Компоненты. Применение.
Реакция связывания комплемента (РСК) отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для:
- серологической диагностики инфекционных заболеваний (р. Вассермана — при сифилисе, р. Борде-Жангу — при хронической гонорее и др.);
- идентификации бактерии и др. микробов.
РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ- АТ-, ещё гемолитическая система, выявляющая результат реакции.
РСК проводится в два этапа при участии двух систем:
- Первая система — АГ+АТ-(-комплемент — обуславливает связывание комплемента в том случае, если АТ соответствует АГ, В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным;
- Вторая система (индикаторная) — гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты — показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки).
В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т.к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент.
Компоненты реакции:
- испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 «С в течение 30 минут);
- антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов);
- комплемент;
- гемолитическая сыворотка;
- 3 % взвесь эритроцитов барана,
- контрольная сыворотка.
Комплемент. В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т.
к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.
Титр комплемента — наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.
Рабочая доза комплемента — количество комплемента, которое выше тира на 25 %.
Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50 % взвесью эритроцитов барана.
Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 °С. Определяют титр и рабочую дозу.
Титр сыворотки — максимальное разведение сыворотки, которая вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.
Реакция связывания комплемента Борде-Жангу
Реакция ставится для диагностики хронической гонореи с целью обнаружения антител к гонококку.
В РСК участвуют 2 системы:
- основная система — испытуемая сыворотка, антиген, комплемент,
- вспомогательная, индикаторная или гемолитическая система — гемолитическая сыворотка и эритроциты барана.
Если в первой системе образуются специфический комплекс антиген + антитело, то комплемент адсорбируется (соединяется с этим комплексом) и гемолиза во второй системе не происходит.
Для реакции требуется:
- Испытуемая сыворотка, которая получается из крови, взятой пункцией локтевой вены больного.
После свёртывания крови сыворотка отсасывается в отдельную пробирку и инактивируется 30 минут при 56 °С на водяной бане.
- Антиген — взвесь убитых гонококков.
- Эритроциты барана получают из стерильно взятой дефибринированной крови.
Их отмывают, центрифугируя 3 раза с новыми порциями физиологического раствора. В реакции используют 3 %-ю взвесь эритроцитов.
- Гемолитическая сыворотка готовится заранее путём иммунизации кроликов эритроцитами барана. Перед употреблением производится титрование сыворотки.
- Комплемент — свежая сыворотка морской свинки.
Из сердца морской свинки шприцем насасывается кровь, после свёртывания отделяется сыворотка. Перед опытом вытитровывается рабочая доза комплемента. Для этого берут основное разведение комплемента 1:10 и разливают его по пробиркам от 0.1 до 0,5, после чего объем в каждой пробирке доводят физиологическим раствором до 1,5 мл.
Одновременно заготавливают гемолитическую систему -разведенная в тройном титре, гемолитическая сыворотка + 3 % взвесь эритроцитов барана.
Оба ингредиента в разных объемах и выдерживают в термостате 30 минут (сенсибилизация смеси), после чего смесь добавляют по 1 мл в пробирки и помещают в термостат на 30 минут. Контролем служат 2 пробирки:
1. 1 мл гемолитической системы + 1,5 мл физиологического раствора;
2. 0,5 мл комплемента 1:10 + 0,5 мл взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологического раствора.
Титром комплемента называется его минимальное количество, при котором ещё происходит гемолиз.
Для постановки реакции берут рабочую дозу комплемента, увеличенную против титра на 20-25 %, т.е., обычно то количество комплемента, которое имеется в предпоследней пробирке с гемолизом.
Увеличение дозы комплемента необходимо потому, что в реакции активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиентами реакции (антиген, сыворотка).
Постановка основного опыта РСК Борде-Жангу
Вначале в 2 пробирки разливается инактивированная и разведённая 1:5 испытуемая сыворотка. Затем в 1-ю пробирку приливается антиген, во вторую — физиологический раствор. После этого во все пробирки добавляется рабочая доза комплемента.
После смешивания ингредиентов штатив с пробирками помещается в термостат при 37 °С на 30 минут (горячее связывание).
При холодном связывании штатив с пробирками помещается в ледник при температуре — 4 «С на 18 часов. После выдерживания в термостате во все пробирки добавляется гемолитическая система.
Реакция ставится в объёме 0,5 мл. Пробирки снова помещают в термостат на 2 часа, после чего производится предварительная регистрация результатов. Пробирки остаются при комнатной температуре, а на следующий день отмечается окончательный результат.
Степень интенсивности реакции оценивается в плюсах. Полная задержка гемолиза — четыре плюса (++++), неполная -три и один плюс. Полный гемолиз обозначается минусами (-).
Реакция связывания комплемента: что это?
Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным.
Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента.
Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О.Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит.
Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.
Компоненты
Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).
Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.
В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.
Механизм
РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним.
В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная.
Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — ан-тиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.
Применение
РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана).
Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Механизм. Способы постановки, применение.
В основе этой реакции лежит способность специфической антитоксической сыворотки нейтрализовать экзотоксин.
Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией.
Реакцию нейтрализации(РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.
Для проведения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свинкам, мышам).
Контрольным животным вводят фильтрат исследуемого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сывороткой, животные опытной группы останутся живыми. Контрольные животные погибнут в результате действия экзотоксина.